1. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ И ТКАНЕЙ. РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОК И ЭКСТРАКЦИЯ
2. ОБЩАЯ ТЕОРИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ. «МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МАЯК» (ММ-ЗОНД) И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ДНК
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ И ТКАНЕЙ. РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОК И ЭКСТРАКЦИЯ
Для изучения свойств белков, установления взаимосвязи их структуры и функций данные биополимеры необходимо выделять из жидких тканей животных (сыворотка крови или молоко) или из таких твердых тканей, как мышцы, печень, кожа, волосы или шерсть. Основным условием при этом является выделение их в химически индивидуальном гомогенном состоянии.
Одна из используемых для выделения белков схем включает стадию измельчения биологического материала (гомогенизация), перевод белков в растворимое состояние (экстракция), а также выделение исследуемого белка из смеси с другими соединениями, т. е. очистка и получение его в индивидуальном состоянии [4].
Для выделения белков из биологического материала последний подвергают измельчению с использованием специфических приемов, приводящему к полной дезинтеграции материала вплоть до разрушения не только клеток, но и внутриклеточных структур, что приводит к переходу растворимых веществ клетки во внеклеточное пространство. Существуют различные методы гомогенизации биологического материала, принципиально отличающиеся друг от друга.
Исторически первыми методами гомогенизации были методы, основанные на механическом разрушении биоматериала, например, растирание образцов тканей пестиком (пестиковый гомогенизатор Поттера-Эльвегейма) или растирание образцов в ступке в присутствии песка, а также гомогенизация под действием быстро вращающихся ножей (гомогенизатор Уорринга).
Способы разрушения клеток биологического материала, из которого выделяется белок, по степени воздействия можно разделить на три группы:
- воздействие средней силы, при котором используют лопастной гомогенизатор или растирание с абразивом (песком, стеклянными шариками);
- мягкое воздействие, которое включает лизис клеток с помощью осмотического шока, разрушение под действием ферментов (лизоцима и др.), химическую солюбилизацию (например, экстракцию дрожжей толуолом, при которой частично растворяется клеточная стенка), гомогенизацию вручную (клетки продавливают через зазор).
2. ОБЩАЯ ТЕОРИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ. «МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МАЯК» (ММ-ЗОНД) И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ДНК
Флуоресценция представляет собой одну из разновидностей «холодного свечения» молекул – люминесценции.
Люминесценция обладает двумя свойствами, принципиально отличающими ее от других излучательных и неизлучательных процессов с участием света: отсутствием зависимости от температуры и большой длительностью, значительно превышающей период излучаемой световой волны.
Флуоресценцией обычно называют излучательный переход возбуждённого состояния с самого нижнего синглетного колебательного уровня S1 в основное состояние S0. В общем случае флуоресценцией называют разрешённый по спину излучательный переход между двумя состояниями одинаковой мультиплетности: между синглетными уровнями S1 – S0 или триплетными T1 – T0. Типичное время жизни такого возбуждённого состояния составляет 10-11−10-6 c [2].
Молекулярные маяки, или зонды молекулярных маяков, представляют собой зонды гибридизации олигонуклеотидов, которые могут сообщать о присутствии определенных нуклеиновых кислот в гомогенных растворах.
Молекулярные маяки представляют собой молекулы в форме шпильки с внутренне гашенным флуорофором, флуоресценция которого восстанавливается, когда они связываются с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени. Это новый нерадиоактивный метод обнаружения конкретных последовательностей нуклеиновых кислот. Они полезны в ситуациях, когда невозможно или нежелательно изолировать гибриды зонд-мишень от избытка гибридизационных зондов.
Типичный зонд молекулярного маяка имеет длину 25 нуклеотидов. Средние 15 нуклеотидов комплементарны целевой ДНК или РНК и не образуют пары оснований друг с другом, в то время как пять нуклеотидов на каждом конце комплементарны друг другу, а не целевой ДНК. Типичную структуру молекулярного маяка можно разделить на 4 части:
- петля, область молекулярного маяка из 18-30 пар оснований, которая комплементарна целевой последовательности;
- ствол, образованный присоединением к обоим концам петли двух коротких (от 5 до 7 нуклеотидных остатков) олигонуклеотидов, комплементарных друг другу.
1. Гуттман, Б. Генетика / Б. Гуттман. – М.: ФАИР-ПРЕСС, 2004. - 126 c.
2. Заяц, Р.Г., Рачковская, И В. Основы общей и медицинской генетики / Р.Г. Заяц. – М.: Высшая школа, 2018. - 415 c.
3. Лелевич, С.В. Клиническая биохимия: Учебное пособие / С.В. Лелевич. - СПб.: Лань, 2018. - 304 c.
4. Митякина, Ю.А. Биохимия: Учебное пособие / Ю.А. Митякина. - М.: Риор, 2019. - 351 c.
5. Сазанов, А. А. Основы генетики: учеб. пособие / А.А. Сазанов. – СПб: ЛГУ им. А. С. Пушкина, 2012. - 214 c.
6. Чернов, Н.Н. Биохимия: практикум / Н.Н. Чернов. - РнД: Феникс, 2017. - 205 c.
