Молекулярная медицина

С помощью полимеразной цепной реакции возможно обнаружение микроорганизмов в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в нем ДНК микроорганизма без выделения последнего в чистую культуру.

Нужно заметить, что обязательное условие проведения полимеразной цепной реакции - это знание нуклеотидной последовательности того либо иного объекта исследования (вируса, бактерии и т.д.). На сегодняшний в банках данных присутствуют почти полные сведения о геноме разных патогенных микроорганизмов.

Принцип ПЦР описал в 1986 году К. Мюллис. Основой метода является многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК по принципу комплементарности, который является маркерным для этого вида возбудителя. In vivo ПЦР будет включать следующие стадии:

1. Денатурация ДНК.

2. Образование коротких двухцепочечных участков ДНК.

3. Синтез новой цепи ДНК.

При многократном повторении циклов репликации будет происходить увеличение числа копий фрагмента ДНК. Все это позволит из единичных клеток микроорганизмов, которые содержаться в анализируемом биологическом материале, получить нужное количество ДНК для их идентификации.

Для проведения ПЦР нужны два праймера, каждый из которых должен быть комплементарным одному из цепей двунитчатой молекулы ДНК. При этом 3'-концы данных синтетических олигонуклеотидов должны быть направлены навстречу друг другу. (Праймером называют короткую олиго- либо полинуклеотидную последовательность со свободной 3’ОН-группой, которая комплементарно связана с однонитевой ДНК либо РНК; с его 3’-конца ДНК-полимераза начнет наращивание полидезоксирибонуклеотидной цепи).

Следовательно, полимеразная цепная реакция является многократно повторяющимися циклами синтеза специфической области ДНК в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидфосфатов, солевого буфера и нуклеотидных праймеров, которые определяют границы синтезируемого участка. Полученная смесь прогревается в течение 1 минуты при температуре 94 °С, при этом комплементарные нити ДНК будут разъединяться. Данный этап называется денатурация ДНК («плавление»).

После этого температура снижается до 45-65 °С (в зависимости от состава олигонуклеотидов) и выдерживается 1,0-1,5 минуты. При этом к образовавшимся в результате денатурации одноцепочечным ДНК будут присоединяться праймеры - один к 3'-концу участка, который выбран для удвоения, второй - к 5'-концу. Данный этап называется «отжиг». На третьем этапе поддерживают температуру 72 °С. Данная температура является оптимальной для работы, применяемой в ПЦР полимеразы. Этот фермент, при использовании дезоксинуклеозидтрифосфатов, содержащихся в смеси, будет достраивать комплементарные цепи ДНК, начиная с 3'-концов праймеров навстречу друг другу. Данный этап называют «элонгацией» (удлинением).

Семейные гиперхолестеринемии (СГ) – это группа генетических нарушений, которые приводят к резкому повышению уровня холестерина в крови.

СГ страдает 1 из 300-500 человек, Данное заболевание - одно из самых распространенных серьезных генетических нарушений. У больных СГ, не прошедших лечение, риск раннего развития ИБС приблизительно в 20 раз выше, чем в общей популяции.

Приблизительно 1 человек на 1 миллион является гомозиготой (либо составной гетерозиготой) по мутации ЛНПР и будет страдать тяжелейшей гиперхолестеринемией, которая без лечения будет быстро приводить к атеросклерозу.

На сегодняшний день выделяют два алгоритма определения больных с семейной гиперхолестеринемией, а именно, анализ фенотипа, то есть клинических признаков (ксантома сухожилий, липоидная дуга роговицы, ксантеллазмы), которые зависят от выраженности и длительности гиперхолестеринемии, и исследования генотипа, поскольку присутствие определенных генетических мутаций приводит к увеличению уровня холестерина в крови и увеличения риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. На сегодняшний день с целью диагностики семейной гиперхолестеринемии используют следующие критерии: британские (Simon Broom Registry), голландские (DLCN - Dutch Lipid Clinic Network), американские (MEDPED - Make Early Diagnosis to Prevent Early Death). Британские и голландские критерии основываются на фенотипических, семейных анамнестических данных и генетических признаках. В зависимости от комбинации данных факторов, в соответствии с голландскими критериями, диагноз семейной гиперхолестеринемии может быть определенным, вероятным и возможным, в соответствии с британским - определенным и вероятным. Критерии MEDPED самые простые для применения, в его основе для постановки диагноза имеет значение только уровень холестерина, который стандартизирован по степени родства и возрасту пациента.

Семейная гиперхолестеринемия, как правило, связана с мутациями в следующих генах: гене рецептора ЛПНП (до 95% случаев), аполипопротеина В-100 (4–5%) и пропротеинконвертазы субтилизин/кексин 9-го типа (1%). Выявление мутации среди членов семьи позволяет установить диагноз. Тем не менее отсутствие выявленных мутаций не исключает диагноза, особенно если фенотип больного с большой долей вероятности указывает на наличие семейной гиперхолестеринемии. Лицам с высокой вероятностью этого заболевания, но с невыявленными мутациями следует провести молекулярно-генетическое исследование методом мультиплексной амплификации лигазно-связанных проб (MPLA).