Введение
Глава 1 Характеристика орозомукоида как белка острой фазы воспаления
Глава 2 Получение рекомбинантного орозомукоида
Глава 3 Выделение и очистка рекомбинантного белка
Заключение
Список использованных источников
Введение
Актуальность темы исследования обусловлена важной ролью орозомукоида или альфа-1-кислого гликопротеина (АГП) в развитии воспалительных реакций в организме человека. АГП относится к острофазным белкам, концентрация которых резко возрастает в крови в ответ на повреждение тканей, воспаление или инфекцию. Повышенный уровень АГП наблюдается при многих заболеваниях печени, почек, онкологических процессах, что позволяет использовать его в качестве диагностического маркера.
Однако механизмы биологического действия АГП в процессах воспаления и регенерации тканей изучены не полностью. Установлено, что АГП может связывать и транспортировать малые гидрофобные молекулы, в том числе продукты перекисного окисления липидов, билирубин, некоторые цитокины и химиотерапевтические препараты. Вероятно, АГП участвует в регуляции воспаления, апоптоза, пролиферации и миграции клеток. Однако молекулярные механизмы этих эффектов остаются невыясненными.
Для исследования функций острофазных белков, в том числе АГП, необходимо получение их в препаративных количествах с использованием методов генной инженерии и клеточных систем экспрессии. В настоящее время разработан широкий спектр подходов для получения рекомбинантных белков в прокариотических и эукариотических системах. Однако существующие протоколы нуждаются в оптимизации для каждого конкретного белка.
Объектом исследования является человеческий орозомукоид или АГП.
Предмет исследования – подходы к получению рекомбинантного АГП с использованием клеточных систем экспрессии и методы выделения и очистки целевого белка.
Цель работы – разработать оптимизированный протокол для экспрессии рекомбинантного АГП в клетках E. сoli с последующей очисткой для получения целевого белка в препаративных количествах.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Сконструировать плазмиду для экспрессии гена АГП в клетках E. сoli.
2. Провести трансформацию плазмидной конструкции в клетки E. сoli штамма BL21(DE3).
3. Оценить уровень экспрессии рекомбинантного АГП в клетках E. сoli при варьировании параметров культивирования.
4. Выделить целевой белок из клеточного лизата и провести его очистку хроматографическими методами.
5. Охарактеризовать полученный рекомбинантный АГП белок-химическими и иммунологическими методами.
Методологической основой исследования являются общенаучные методы познания – анализ, синтез, моделирование. В работе будут использованы такие методы как генная инженерия, клеточная и белковая биотехнология, хроматография, электрофорез, иммунохимический анализ.
[...]
Глава 1 Характеристика орозомукоида как белка острой фазы воспаления
Орозомукоид (α1-кислый гликопротеин) является одним из основных белков острой фазы плазмы крови человека. Он синтезируется в печени и его уровень может увеличиваться в 3-4 раза при воспалительных процессах, травмах или ожогах [1, c. 2].
Структура орозомукоида.
Орозомукоид представляет собой единичную полипептидную цепь, состоящую из 181 аминокислотного остатка. Молекулярная масса белка – около 41-43 кДа. Орозомукоид является гликопротеином, на его молекуле имеется 5 участков №-гликозилирования, 4 из которых заняты олигосахаридными цепочками. Доля углеводного компонента составляет примерно 45% от общей массы молекулы.
Олигосахаридные цепи, присоединенные к белку, состоят из 2-5 остатков №-ацетилнейраминовой кислоты, галактозы, маннозы, фукозы и №-ацетилглюкозамина. Сахаридные цепочки являются весьма гетерогенными по составу и строению из-за возможности различных вариантов гликозидных связей.
Физико-химические свойства.
Орозомукоид обладает высокой растворимостью в воде и физиологических растворах. Он устойчив в кислой среде, сохраняет нативную структуру и биологическую активность при рН от 2 до 10.
Температура плавления орозомукоида составляет около 114°C, температура денатурации – 62-68°C.
Белок способен взаимодействовать с различными лигандами, образуя комплексы за счет гидрофобных и ионных взаимодействий.
Молекула орозомукоида несёт отрицательный заряд, её изоэлектрическая точка находится при рН 2,8. При физиологических значениях рН орозомукоид находится в форме аниона.
Благодаря гидрофобным и ионным взаимодействиям белок может образовывать комплексы с гидрофобными лигандами, такими как билирубин, стероиды, некоторые лекарства. Помимо этого, орозомукоид способен взаимодействовать с цитокинами, гормонами и иммуноглобулинами.
Орозомукоид проявляет четыре типа связывания:
1) Высокоаффинное и специфическое взаимодействие с кортизолом.
2) Слабое связывание тироксина и трийодтиронина.
3) Взаимодействие со стероидными гормонами (прогестерон, тестостерон, эстрадиол и др.)
4) Неспецифическое связывание с большим числом гидрофобных лигандов [1, c. 3].
[...]
Глава 2 Получение рекомбинантного орозомукоида
Орозомукоид является сложным гликозилированным белком человека. Для его экспрессии можно рассмотреть несколько возможных систем – в бактериях, дрожжах, клетках млекопитающих. Рассмотрим их основные характеристики [2, c. 24]:
Бактериальная экспрессия:
В бактериальных системах чаще всего используется Escherichia coli – хорошо изученная платформа для синтеза рекомбинантных белков. Бактерии быстро растут, позволяют получать высокую биомассу и экспрессировать большие количества целевого белка.
Орозомукоид содержит 5 гликозилированных участков, для правильной посттрансляционной модификации которых нужны специфические ферменты. В бактериях возможности для гликозилирования крайне ограничены. Бактерии не смогут добавить к белку сложные олигосахаридные цепочки, в результате экспрессии получится неработоспособный либо неактивный белок. Для частичного решения этой проблемы возможна коэкспрессия необходимых гликозилтрансфераз из других организмов, что усложняет систему.
Дрожжевая экспрессия:
Эукариотические дрожжи, чаще всего Pichia pastoris, обладают хорошо развитым аппаратом посттрансляционной модификации белков. Они потенциально способны гликозилировать человеческие белки с большей точностью по сравнению с бактериями.
Однако имеет место гипергликозилирование белков, т.е добавление избыточного числа олигосахаридных цепочек. Кроме того, возникает неправильная структура цепей – преимущественно дрожжевого типа. В итоге белок получается функционально неактивным и вызывает иммунный ответ организма человека. Ещё одним минусом системы может быть высокий уровень примесей.
Экспрессия в клетках млекопитающих
Для экспрессии орозомукоида оптимальным вариантом выглядит использование клеточных культур млекопитающих, в первую очередь CHO-клеток (яичника китайского хомячка) или HEK293 (эмбриональных клеток почки человека). Эти клеточные линии обеспечивают необходимый набор кофакторов и ферментов для всех этапов синтеза и правильного посттрансляционного гликозилирования белка. В результате получаются молекулы орозомукоида с нативной для человеческого организма структурой углеводных цепей. По сути синтезируется полностью идентичный нативному белок, готовый к применению в медицине.
[...]
Глава 3 Выделение и очистка рекомбинантного белка
После получения стабильной клеточной линии, экспрессирующей орозомукоид, проводят процедуру лизиса клеток с целью выделения целевого продукта. Существует несколько подходов [7, c. 23]:
1. Механический лизис.
Один из наиболее простых и доступных методов. Клеточную взвесь обрабатывают в гомогенизаторе или пропускают через пресс для разрушения клеточных мембран и высвобождения содержимого. Гомогенат затем центрифугируют для осаждения органелл и получения супернатанта с растворимой фракцией белков.
Преимущества: простота, низкая стоимость.
Недостатки: высокий риск денатурации лабильных белков, значительное разрушение ДНК/РНК.
2. Гипоосмотический шок.
Клетки помещают в гипотонический буфер, в результате чего происходит набухание и разрыв клеточных мембран за счет осмотического шока. Эффективный выход растворимых белков из цитоплазмы.
Преимущества: простота, сохранение структуры белков.
Недостатки: наработка меньшего количества материала по сравнению с детергентным лизисом.
3. Детергентный лизис.
Используют поверхностно-активные вещества (Тритон Х-100, НП-40 и др), которые нарушают целостность липидного бислоя, приводя к растворению мембран. Эффективный метод получения растворимой фракции клеточных белков.
Преимущества: высокий выход целевого продукта, сохранение растворимости.
Недостатки: трудноудаляемые детергенты, вероятность денатурации части белков.
После лизиса методом центрифугирования проводят разделение клеточного лизата на растворимую (супернатант) и нерастворимую фракции. Орозомукоид будет локализоваться преимущественно в растворимой фракции, из которой в дальнейшем и выделяется необходимый рекомбинантный белок методами очистки.
Для повышения выхода орозомукоида проводят его концентрирование и осаждение сульфатом аммония, ацетоном или этанолом. Затем осадок растворяют и направляют на последующую хроматографическую очистку.
Таким образом, из перечисленных подходов оптимальным для выделения целевого орозомукоида представляется применение детергентного лизиса клеток с последующим осаждением и растворением белка перед хроматографией. Это позволит получить его с высоким выходом и в растворимом функциональном виде.
[...]
Заключение
Орозомукоид (альфа-1-кислый гликопротеин) является одним из ключевых белков острой фазы воспаления, синтезируемых в печени. Его уровень в крови значительно повышается при воспалительных процессах, травмах и ожогах.
Орозомукоид представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около 41-43 кДа, состоящий из полипептидной цепи и олигосахаридных фрагментов. Благодаря своему строению он способен связывать множество различных лигандов.
Орозомукоид выполняет разнообразные биологические функции: транспортную (переноска гидрофобных веществ), иммуномодулирующую (регуляция иммунного ответа), антикоагулянтную (ингибирование свертывания крови), регенеративную (стимуляция заживления ран), защитную (связывание токсинов) и регуляторную (поддержание метаболизма и гомеостаза).
Повышение уровня орозомукоида в крови является высокочувствительным диагностическим маркером развития воспалительного процесса в организме, что широко используется в клинической практике.
Орозомукоид представляет собой мультифункциональный белок, играющий ключевую роль в процессах воспаления, гемостаза, транспорта гидрофобных соединений и поддержания гомеостаза при стрессе и повреждениях тканей.
Для получения рекомбинантного орозомукоида, являющегося сложным гликозилированным белком, наиболее подходящей системой экспрессии являются клеточные линии млекопитающих (CHO, HEK293), обеспечивающие правильное посттрансляционное гликозилирование согласно человеческому типу.
Бактериальные и дрожжевые системы экспрессии неприемлемы, так как они не способны провести гликозилирование орозомукоида должным образом, что приведет к получению неактивной формы белка.
Для экспрессии орозомукоида в клетках млекопитающих необходимо сконструировать специальную плазмидную векторную систему, содержащую ген целевого белка под контролем сильного промотора, сигнальной последовательности для секреции и селективного маркера устойчивости.
Оптимизация плазмиды (подбор кодонов, регуляторных элементов) и условий культивирования клеток позволяет значительно увеличить выход целевого рекомбинантного орозомукоида.
Введение плазмиды в клетки-хозяина осуществляется путем трансфекции (фосфат-кальциевый метод, липофекция, электропорация), затем проводится селекция стабильно трансфицированных клеток-продуцентов.
Для достижения максимального уровня синтеза необходим скрининг множества клеточных клонов и отбор наиболее активного продуцента орозомукоида.
[...]
1. Bertolini, L.R. Therapeutic potential of recombinant proteins produced in mammalian cells // Cytotechnology. – 2022. – Vol. 74. – P. 1-22.
2. Derappe, C. The biosynthesis of human plasma alpha 1-acid glycoprotein and its contribution to disease // Protein and Peptide Letters. – 2018. – Vol. 25, №. 1. – P. 24-35.
3. Hashemi, Z.S. Chromatographic Methods for Purification of Recombinant Proteins // Separation Science and Technology. – 2020. – Vol. 55, №. 11. – P. 1996-2015.
4. Kumar, M. Recombinant therapeutic proteins: Fermentation, bioprocessing and advances in production processes // Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. – 2023. – Vol. 39, № 1. – P. 1-33.
5. Protein Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) / Ed. D. Walls, S.T. Loughran. – Humana Press, 2021. – 388 p.
6. Вашкау, И.В. Белки острой фазы: структура, функции, клиническое значение / И.В. Вашкау, Е.В. Максимович // Вестник ВГМУ. – 2019. – Т. 18, № 3. – С. 7-17.
7. Гончар, И.В. Белок острой фазы альфа-1-кислый гликопротеин как потенциальный маркер рака / И.В. Гончар, Д.Л. Тяжелов // Онкогематология. – 2017. – Т. 12, № 1. – С. 23-31.
8. Кутузова, Н.М. Экспрессия рекомбинантных белков в линиях клеток млекопитающих / Н.М. Кутузова, А.С. Раков // Успехи молекулярной биологии. – 2021. – Т. 49, № 2. – С. 204-223.
