Генетика Контрольная

Какую ткань лучше брать для введения в культуру: эмбриональную или взрослую, опухолевую или нормальную? Известно, что культуры, которые получены из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом. Это исходит из низкого уровня специализации, а так же наличия реплицирующихся клеток-предшественниц. У взрослых тканей способность к пролиферации много ниже, и, как следствие, они содержат большее количество уже не делящихся дифференцированных клеток. [5]

При получении и поддержании культур клеток следует различать первичные культуры и клеточные линии. Первичные культуры получают непосредственно из нормальных или опухолевых тканей человека или животных методом эксплантации или трипсинизации тканей. Чаще всего методом трипсинизации получают культуры эпителиальных клеток или фибробластов. [11] Общим для всех способов получения первичных однослойных культур путем трипсинизирования  является обработка тканей трипсином, реже химотрипсином, папаином, панкреатином, гиалуронидазой или коллагеназой. Ткань измельчается в стерильных условиях ткань, промывается и помещается в раствор фермента на магнитную мешалку. Полученную суспензию клеток центрифугируют, осадок разводят ростовой средой до оптимальной концентрации. После посева в культуральные флаконы клетки прикрепляются к стеклу и адаптируются к условиям in vitro (фаза стабилизации, lag-фаза), затем они начинают активно пролиферировать (фаза логарифмического роста, log-фаза), вступая в стационарную фазу с образованием монослоя. [4]

Правда, продолжительность жизни таких культур невелика, поэтому получение их является нелегкой задачей. Однако первичные культуры полученные из опухолевых тканей способны пролиферировать неограниченно во времени, в отличие от эксплантов их нормальных тканей. Это связанно с тем, что дифференцировка клеток в нормальных тканях обычно сопровождается полным прекращением пролиферации, а в культурах, полученных из опухолевой ткани, клетки способны дифференцироваться частично с сохранением пролиферации. [9] 

Важно знать, что свежевыделенные культуры называются первичными лишь до начала пассирования или субкультивирования. Клетки первичной культуры – гетерогенные и характеризуются низкой пролиферацией. Наибольший процент в культуре составляют клетки того тепа ткани, откуда были получены. Пассирование обеспечивает следующие  возможности: 1 – продление времени жизнеспособности культуры; 2 – клонирование клеток; 3 – проведение различных исследований; 4 - сохранение свойств клеток. При этом получаются более однородные популяции, а также теряются дифференцированные клетки. После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет, либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией. [5]

Отличительной чертой растительных клеточных культур является характерное для клеток растений свойство тотипотентности. Благодаря ему соматические клетки способны полностью реализовывать генетическую информацию и, следовательно, способны обеспечить развитие целого растения.  Так же, в отличие от животной, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования. [2]

Важными компонентами, входящим в состав питательных сред, являются фитогормоны. Добавляя те или иные гормоны в среду культивирования можно вызвать или затормозить дифференциацию клеток. Растительные клетки способны за крайне короткий, в сравнении с животными, образовывать многочисленные популяции в ограниченном пространстве. Клетки в условиях in vitro лишаются очень многих важных взаимодействий, которые определяют их судьбу и дифференциацию в целом организме. В определенных пределах дифференциация культивируемых клеток поддается контролю со стороны экспериментатора. [16]

Основным типом культуры, получаемой чаще всего, является каллусная ткань. Она представляет собой один из видов клеточной дифференциации, возникающей путем неорганизованного деления дедифференцированных клеток.  Данный тип ткани характерен и in vivo, но только в исключительных случаях, например для закрытия травм. Она способна накапливать питательные вещества для регенерации, а так же защищает раневую поверхность от заражения. Но каллус может возникнуть не только вследствие травмы, но и из-за нарушения гормонального баланса. Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей различных органов высших помещают на искусственную среду, содержащую ауксины, в пробирки, колбы, чашки Петри (in vitro). В качестве ауксинов используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), a-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолил-масляную кислоту (ИМК), индолилуксусную кислоту (ИУК) в том диапазоне концентраций, который характерен для данного вида экспланта. [8]

Одним из важнейших гормонов, который применяется при культивировании in vitro является ауксин, который активирует деление и растяжение клеток – индолил-маслянная кислота. Проникая в клетки, ИУК связывается со своими рецепторами и оказывает влияние на функциональную активность мембран клетки, полирибосом и работу ядерного аппарата. Установлено так же, что в плазмалемме ауксин индуцирует работу Н+-помпы, результатом чего является размягчение матрикса клеточных стенок, что является необходимым условием для роста и растяжения клеток. [16]

Цитогенетическая диагностика – ключевое звено медицинской генетике. Первое и главное условие данной диагностики — наличие клеток в фазе деления в цитологическом препарате.  Подходящими тканями для исследований с помощью методов  цитогенетики являются костный мозг, ткани семенника и хорион, так как они имеют достаточный митотический индекс. Но использование именно культур клеток, а не фрагментов ткани, выделенных из организма показали себя наиболее информативною. Митотический индекс  культуры клеток намного выше, нежели у дифференцированной ткани.

Вторым условием цитогенетической методологии является использование колхицина – вещества, разрушающего веретено деления и останавливающего клеточное деление на стадии метафазы. [6]

Приготовление цитогенетического препарата костного мозга.

Рассмотрим пример приготовления препарата на примере препарата ткани костного мозга. Изначально готовится клеточная суспезиальная культура, которая обрабатывается колхицином.  Далее клетки тщательно суспедизируются в фиксаторе и несколько капель наносятся на предметное стекло. Стекло должно быть охлажденным и увлажненным. Будущий препарат несколько раз быстро проносится через пламя спиртовки для того, чтоб фиксатор испарился. Фиксатор должен испариться полностью, но стекло не должно долго обжигаться – это неблагоприятно влияет на препарат. После сгорания фиксатора стекло высушивается в струе теплого воздуха. Одно из обязательных условий получения хороших препаратов – качество и чистота предметных стекол. 

Готовые препараты хранятся в специальных коробках для избегания попадания пыли и других загрязнений. [5]

Получение препаратов хромосом

Получение хороших препаратов хромосом до 1960 года представляло существенную проблему. Для этого необходимо было исследовать клетки тканей, обладающих высокой пролиферативной активностью. К началу 60-х годов XX столетия усилиями нескольких исследователей был разработан достаточно эффективный метод получения препаратов хромосом из лейкоцитов периферической крови человека.

В наше время известно более 2500 болезней, связанных с нарушением обмена веществ, передающихся по наследству, но только для 300 установлен генетический дефект, вызывающий блокировку синтеза фермента. Во многом, проявления наследственных болезней нарушения обмена веществ во многом проявляются в поражениях нервной системы. 

Выделяют следующие классы болезней, связанных с наследуемыми нарушениями обмена веществ: 

1. Наследственные заболевания аминокислотного обмена – нарушения, связанные с метаболизмом аминокислот в организме. Они приводят к нарушению нормального функционирования организма человека.[7] К ним относят:

- Фенилкетонурию (ФКУ). Это заболевание впервые было описано в 1934 г. Фолингом под названием "фенилпировиноградная имбецильность". Болезнь носит аутосомно-рецессивный тип наследования. Частота заболевания составляет 1:10000- 1:20000 новорожденных. К развитию заболевания приводит недостаток фенилаланингидроксилазы, а так же и недостаточность редуктазы дигидроптерина- 2-го фермента, который обеспечивает гидроксилирование фенилаланина. Все это приводит к накоплению фенилаланина в жидких средах организма. Фенилаланин относится к незаменимым аминокислотам. Поступающий с продуктами питания и не используемый для синтеза белка, он распадается по тирозиновому пути. [7] При ФКУ наблюдается ограничение превращения ФА в тирозин и, соответственно, ускорение его превращения в фенилпировиноградную кислоту и другие кетоновые кислоты, что в итоге приводит к развитию умственного дефекта, судорожного синдрома, нарушению координации движения и прочим клиническим проявлениям. [1, 10]

- Болезнь Гартнепа. Имеет так же аутосомно-рецессивный тип наследования. При развитии данного заболевания наблюдается генетически обусловленное изменение транспортной функции клеток слизистой оболочки кишечника и проксимальных отделов почечных канальцев. Это ведет к нарушению транспорта моноаминокарбоновых кислот. Нарушение кишечной абсорбции триптофана приводит к его бактериальному расщеплению в кишечнике до индола и индоксила. [7] Для этой болезни характерны: кожная фоточуствительность, пеллагроподобный дерматит, мозжечковая атаксия с вовлечением в процесс пирамидных путей, нарушение функции желудочно-кишечного тракта. [1] Так же вероятна умственная отсталость.[10] 

- Галактоземия. Классическая галактоземия наследуется также аутосомно- рецессивному типу. Она занимет второе после ФКУ место по частоте встречаемости. При заболевании наблюдается харатерный для него дефицит галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазы. В классическом развитии болезни активность данного фермента у гомозигот в эритроцитах почти не определяется, а у гетерозигот составляет 50 % нормы. [7] Для данного заболевания так же характерно раннее проявление клинической картины: анорексия, рвота, непереносимость молока, задержка увеличения массы тела, катаракта, гепатомегалия, желтуха, отеки, геморрагические проявления, спленомегалия, поражение ЦНС. [1] Так же возможно развитие с возрастом умственной отсталости, но не столь выраженной, как при ФКУ.[10]