Молекулярная медицина Контрольная

Полимеразная цепная реакция, ПЦР (polymerase chain reaction, PCR, греч. polymeres – состоящий из многих частей, многообразный; лат. Re – приставка, обозначающая повторность действия, nactio – действие) – ферментативная реакция, осуществляемая in vitro с помощью термостабильной ДНК-полимеразы на матрице ДНК с использованием олигонуклеотидных ДНК-затравок (праймеров), комплементарных нуклеотидным последовательностям противоположных цепей ДНК на границах амплифицируемого участка. ПЦР представляет собой серию из 3-х циклически повторяющихся реакций (обычно в сумме осуществляют 20-30 циклов): денатурация ДНК, отжиг ДНК-затравок с матрицей и синтез ДНК с помощью ДНК-полимеразы с каждой из затравок навстречу друг другу с использованием противоположных цепей ДНК в качестве матриц. По завершении каждого цикла количество синтезированного продукта удваивается и происходит увеличение количества анализируемой ДНК в геометрической прогрессии, что позволяет в миллионы раз увеличивать количество изучаемого фрагмента ДНК в пробе. ПЦР используется для клонирования и секвенирования ДНК, при картировании генов, в генной инженерии и медицинской ПЦР-диагностике. Предложена К. Мюллисом в 1985 г. (Нобелевская премия за 1993 г.).

ПЦР позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (несколько десятков пар нуклеотидов ДНК или РНК) любого организма, содержащийся в следовых количествах среди огромного количества нуклеотидных последовательностей иной природы, и быстро размножить его. По сути дела метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, только повторяющуюся с огромной скоростью и столько раз, сколько это необходимо исследователю.

Метод включает несколько этапов: расплетание двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и последующее комплементарное дополнение (достройку) обеих с помощью специального фермента. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках.

Для проведения такого процесса используют две генетические пробы (праймеры), которые служат в качестве затравки для синтеза второй цепи на однонитевой ДНК. Праймеры – это искусственно синтезированные короткие нуклеотидные последовательности (15-30 нуклеотидов), комплементарные концам размножаемых (амплифицируемых) участков нитей ДНК. Понятно, что, чтобы иметь нужные праймеры, необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка ДНК, который требуется размножить. 

Существует два принципиальных способа введения генетической информации в больной организм.

В первом из них берут клетки из организма, вводят в них требуемую генетическую информацию и затем возвращают в тот же организм. Это свои клетки, иммунная система их не отторгает, так, по-крайней мере, можно надеяться, и они далее синтезируют нехватающий организму продукт. Не все клетки годятся для этого способа. Годятся, только те, которые могут существовать долго, лучше всего на протяжении всей жизни организма.

Это стволовые клетки. Определим этот способ, как ex vivo генную терапию. Экс значит вне. Внеорганизменная генная терапия. Эта терапия представляет собой развитие методов лечения, основанных на трансплантации органов и тканей.

Другой подход - доставка генов прямо в организм, ничего из него не вынимая. Это называется in vivo генная терапия. Прямо, значит, в организме. Выбор стратегии определяется той медицинской задачей, которую решает генная терапия в каждом конкретном случае.

Наконец, чтобы закончить с определениями, надо сказать о следующем. Принципиально наследственные болезни можно было бы лечить раз и навсегда, вводя здоровые гены в зародышевую линию клеток, так чтобы они передавались по наследству. Мы это делали в случае трансгенных животных. Это была бы генная терапия зародышевых клеток. Но человек не мышь и не корова, и здесь возникает столько проблем, и технических и главным образом этических, что такой подход сегодня просто не рассматривается. Речь всегда идет о введении генетической информации в соматические клетки. Мы имеем дело с соматической генной терапией.

Если фетальная генотерапия пока неприменима для лечения наследственных болезней человека, то соматическая генотерапия наследственных болезней проходит клинические испытания.

Есть разные методы введения чужеродной ДНК в клетки-мишени, и выбор метода частично зависит от заболевания. Доставку генетического материала производят с помощью вирусных векторов (ретровирусы, не способные к самостоятельной репликации; аденовирусы; аденоассоциированные вирусы; герпесвирусы и др.) или невирусных систем (липосомы, конъюгаты ДНК-белок и ДНК-белок-дефектный вирус). Существуют два подхода: ex vivo –  сначала генетический материал вводят в клетки, выращиваемые в культуре, а затем трансгенные клетки вводят реципиенту, и in vivo - вектор, несущий нужный ген, вводят непосредственно в организм реципиента (рисунок 2).

Метод ПЦР позволяет получить большое количество синтезированного продукта, что позволяет достаточно точно и детально его изучить. Метод ПЦР позволяет клонирования и секвенировать необходимую ДНК, провести картирование генов, осуществить цели генной инженерии и осуществить проведение медицинской ПЦР-диагностики. 

Соматическая генотерапия необходима доля проведения лечения сложных генетических заболеваний, трудно поддающихся медикаментозным методам лечения. Но, смотря на множество открытий в сфере генотерапии и генетической инженерии, требуется множество испытаний, направленных на доставку и коррекцию генов. Лечение галактоземии и комбинированного иммунодефицита методом генной инженерии находится на этапе испытаний, получены как положительные, так и безрезультатные выводы об эффективности генотерапии.