Введение
1 Окислительный стресс в растительных клетках
2 Механизмы антиоксидантной защиты растительной клетки
2.1 Антиокислительные ферменты
3 Влияние физиологически активных веществ на активность ферментов антиоксидантной защиты
4 Методы определения активности ферментов антиоксидантной защиты растений
4.1 Определение активности растворимой пероксидазы
4.2 Определение активности аскорбатпероксидазы
4.3 Определение активности каталазы
4.4 Определение активности супероксиддисмутазы
4.5 Определение активности глутатионредуктазы
4.6 Определение активности глутатионпероксидазы
4.7 Определение активности глутатион-S-трансферазы
Заключение
Список использованных источников
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время культуры растительных клеток являются объектом биотехнологии для получения целевых продуктов, поэтому целесообразность изучения ферментов-антиоксидантов в процессе выращивания растительных тканей in vitro в стандартных условиях, при воздействии неблагоприятных воздействий, а также сопоставление продолжительности жизни биологических объектов с их обеспеченностью этими важнейшими антиоксидантами, участвующими в защите организма от токсического воздействия кислорода [1].
Актуальность темы: В клетках живых организмов всегда присутствуют активные формы кислорода. При относительно умеренных и низких неповреждающих концентрациях они вовлекаются в нормальный метаболизм клетки. Структурные и функциональные нарушения, вызванные стрессами, как правило, усиливают активацию кислорода. Радикалы кислорода и продукты их превращения представляют серьезную угрозу для живого организма, так как могут подавлять активность ферментов, вызывать мутации нуклеиновых кислот, деградацию биополимеров, изменять мембранную проницаемость и т.д. В результате эволюции у аэробов возникли защитные механизмы, к которым относятся специализированные ферментные и неферментные антиоксидантные системы. Главную роль в защите от кислородных интермедиантов играют ферменты, способные обезвреживать супероксидные радикалы и перекисные соединения в клетках.
1 ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС В РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТКАХ
Появление молекулярного кислорода, в основном, как побочного продукта фотосинтеза явилось значительным событием в биологической эволюции и имело два важных следствия. Во-первых, в клетке были сформированы механизмы утилизации этого вещества путем использования его в качестве универсального акцептора электронов при окислении широкого круга субстратов. Во-вторых, как эукариотные, так и прокариотные организмы, постоянно сталкиваясь с кислородом в своей жизнедеятельности, оказались перед необходимостью выработать физиологические и молекулярные механизмы, препятствующие его токсичности. Все организмы, которые используют кислород и, следовательно, содержат его и различные продукты восстановления, должны защитить себя от токсичности кислорода [3].
В своем основном состоянии молекулярный О2 сравнительно неактивен, но он способен формировать потенциально летальные реактивные возбужденные состояния, такие как свободные радикалы (СР) и их производные.
Термин «активированный кислород» (или «активные формы кислорода» (АФК) наиболее часто используется в биологической литературе и обозначает совокупность коротко живущих, взаимопревращающихся и относительно реакционноспособных форм кислорода, возникающих в результате его электронного возбуждения или окислительно-восстановительных превращений. АФК – это общее название для супероксидного анион-радикала (О2−∙), гидроксильного радикала (˙ОН), а также пероксида водорода (Н2О2) и синглетного кислорода (О2-) – нестабильных и высокореакционноспособных веществ [3].
Около 1% кислорода, присутствующего в растении, превращается в активированный кислород в различных субклеточных локусах: хлоропластах, митохондриях, плазмалемме, микросомах, пероксисомах, глиоксисомах, клеточной стенке. Существуют многочисленные механизмы и сигнальные трансдукционные пути, ведущие к генерации АФК. Образование АФК можно рассматривать как побочную реакцию, сопровождающую процессы переноса электронов по
2 МЕХАНИЗМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
Поскольку активированные формы кислород высоко токсичны, они непрерывно находятся под контролем организма. Известны два различных механизма защиты: уменьшение образования АФК и функционирование антиоксидантной системы [7].
Важнейшими высокомолекулярными антиоксидантами растений, непосредственно обезвреживающими АФК, выступают специализированные ферментные системы (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза и т.д.) способные тормозить или устранять свободнорадикальное окисление органических веществ, и белки, способные связывать металлы с переменной валентностью. Ферменты-антиоксиданты, обеспечивающие комплексную защиту биополимеров от АФК, расположены в различных клеточных компартментах, имеют разную субстратную специфичность и сродство с активными формами кислорода.
Ферменты АОС принимают участие в регуляции метаболизма в ходе онтогенеза и имеют особую важность для растений в обеспечении быстрой приспособленности к постоянно меняющимся условиям внешней среды. Наличие нескольких ферментов, выполняющих одну и ту же каталитическую функцию, – весьма ценное свойство, расширяющее адаптационные возможности организма, что особенно важно для жизнедеятельности растений – организмов, не имеющих стабильной внутренней среды [8].
При окислительном стрессе ферментативная антиоксидантная система может становиться неэффективной. Причины этого – быстрая инактивация конститутивного пула ферментов свободными радикалами, значительное время необходимое для индукции их синтеза. В этих условиях повышается значение низкомолекулярных неферментативных антиоксидантов.
Низкомолекулярными антиоксидантами являются различные по структуре и химическим свойствам соединения, способные взаимодействовать с кислородными и органическими радикалами, ингибировать протекание свободнорадикальных
ГЛАВА 3 ВЛИЯНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ
В клетках существуют антиоксидантные системы, осуществляющие нейтрализацию АФК и, следовательно, предотвращающие повреждения клеток. Эти системы включают в себя как низкомолекулярные небелковые антиоксиданты (каротиноиды, пролин, аскорбат, глутатион, флавоноиды и др.), так и специфические ферменты-антиоксиданты (СОД, КАТ, пероксидазы и др.) и SH-белки. Исследование особенностей функционирования антиоксидантных систем важно для понимания того, как растения адаптируются к антропогенно измененным условиям среды [13].
Активность вышеперечисленных ферментов может сильно меняться в зависимости от того, в каких условиях находится растение. В настоящее время существует много публикаций, посвященных выяснению адаптаций растений к стрессу, вызванному тяжелыми металлами, при помощи систем ферментов антиоксидантной защиты.
В модельных системах исследована взаимосвязь между активностью антиоксидантных систем растений и их устойчивостью к неорганическим (тяжелые металлы) и органическим (мочевина и фенольные соединения) поллютантам.
Удобнее рассмотреть, как отдельные компоненты загрязнения влияют на активность изучаемых ферментов антиоксидантной защиты. Одним из наиболее опасных поллютантов является кадмий. При действии на растения гороха кадмия в повышенных концентрациях активность СОД возрастала на 44%, а активность пероксидаз – на 24%. В этих опытах активность возрастала во всех вариантах, отличных от контроля. В исследованиях Шевяковой на хрустальной травке показано, что в условиях Cd- стресса значительно возрастала активность гваяколовых пероксидаз [1].
Значительное количество публикаций посвящено действию на растительные организмы ионов меди. Деви и Прасад на Brassica juncea показали, что при
4 МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ
4.1 Определение активности растворимой пероксидазы
Колориметрический метод определения активности пероксидазы по Бояркину. Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина до образования синего продукта его окисления в присутствии перекиси водорода и пероксидазы [17].
Необходимые реактивы:
1) 0,2 М Na-ацетатный буфер (рН 5,0). Его готовят из следующих концентрированных растворов (сток-растворов): 0,2 М CH3COOH (2,4 мл CH3COOH довести до 200 мл дистиллированной водой), 0,2 М CH3COONa (5,44 г CH3COONa довести до 200 мл дистиллированной водой).
В определенных случаях критичным является приготовление растворов на сверхчистой (деионизированной, свободной от бактерий и твердых частиц) воде, полученной с помощью системы Milli-Q (“Millipore”, Франция), далее по тексту - mQ.
Расчет активности пероксидазы и других ферментов в относительных единицах на один грамм сухого веса проводится по формуле:
A = (ΔD•V•X)/(T•L•m•Δm), (1)
где:
А – активность фермента,
ΔD – изменение оптической плотности (вычесть из оптической плотности в
конце реакции оптическую плотность в начальный момент времени),
V – общий объём полученной вытяжки, мл
X – конечное разведение вытяжки в кювете (объём реакционной смеси
разделить на количество вносимого экстракта),
T – время реакции, с,
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Антиоксиданты - вещества, замедляющие или предотвращающие окисление органических соединений. Они защищают организм от негативных воздействий свободных радикалов.
Антиоксидант соединяется со свободным радикалом и ставит заслон разрушительному действию лишнего электрона. С помощью ферментной защитной системы организм преобразует клеточный оксидант в воду и кислород.
Важнейшими высокомолекулярными антиоксидантами растений, непосредственно обезвреживающими АФК, выступают специализированные ферментные системы (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза и т.д.).
Активность ферментов может сильно меняться в зависимости от того, в каких условиях находится растение.
Существует большое количество методов определения активности ферментов (колориметрический, спектрофотометрияеский и др.).
1.Биологически активные вещества растений — изучение и использование материалы международной научной конференции 29–31 мая 2013 г., г. Минск. – Минск : ГНУ «Центральный ботанический сад Академии наук Беларуси», 2013. – 356 с.
2.Деви, С.Р. Антиокислительная активность Brassica juncea, подвергнутых действию высоких концентраций меди / С.Р. Деви, М.Н. Прасад //Физиология растений. – 2005. – Т.52. – № 2. – С. 233-237.
3.Кулинский, В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза вред и защита / В.И. Кулинский // Соросовский образовательный журнал. – 1999. – № 1. – С. 2-7.
4.Физиология растений: Учебник для студентов вузов /под ред. И.П. Ермакова. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 640 с.
5.Методы биохимического анализа растений // Учебное пособие (Ред.: Полевой В.В., Максимов Г.Б. - Л.: изд-во Ленингр. Ун-та. - 1978. - 192 с.
6.Полесская, О.Г. Изменение активности антиоксидантных ферментов в листьях и корнях пшеницы в зависимости от формы и дозы азота в среде / О.Г. Полесская [ и др.] // Физиология растений. - 2004.- Т. 51. - С. 686-691.
7.Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений: учебно-методическое пособие / Сибгатуллина Г.В., Хаертдинова Л.Р., Гумерова Е.А., Акулов А.Н.,Костюкова Ю.А., Никонорова Н.А., Румянцева Н.И. – Казань: Казанский (Приволжский) Федеральный университет, 2011. – 61 с.
8.Чупахина, Г.Н. Природные антиоксиданты (экологический аспект): монография / Г.Н. Чупахина [и др.]. — Калининград: Изд-во БФУ им. И. Канта, 2011. — 111 с.
9.Аверьянов, А.А. Активные формы кислорода и иммунитет растений / А.А. Аверьянов // Успехи современной биологии. – 1991. – Т. 111. – № 5. – С. 722-737.
10.Андреева, В.А. Фермент пероксидаза: участие в защитном механизме растений / В.А.Андреева. – М.: Наука, 1988. – С. 7–24.
11.Барабой, В.А. Перекисное окисление и стресс / В.А. Барабой, И.И. Брехман, В.Г. Голотин, Ю.Б. Кудряшов. – СПб.: Наука, 1992. – 148 с.
12.Барабой, В.А. Растительные фенолы и здоровье человека / В.А. Барабой. – М.: Наука, 1984. – 160 с.
13.Бояркин, А.Н. Быстрый метод определения активности пероксидазы / А.Н. Бояркин // Биохимия. – 1951. – Т. 16, вып. 4. – С. 352-355.
14.Бояркин, А.Н. Быстрый метод определения активности полифенолоксидазы / А.Н. Бояркин // Тр. Ин-та физиологии растений. – 1954. – Т. 8. – № 2. – С. 398-403.
15.Воскресенская, О.Л. Физиология растений: Учебное пособие / О.Л. Воскресенская, Н.П. Грошева, Е.А. Скочилова. - Йошкар-Ола: Мар. гос. ун-т., 2008. – 175 с.
16.Абдулин, И.Ф. Органические антиоксиданты как объекты анализа / И.Ф. Абдулин, Е.Н. Турова, Г.К. Будников // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. – 2001. – Т.167. № 6. – С.3-13.
17.Аверьянов, А.А. Активные формы кислорода и иммунитет растений / А.А. Аверьянов // Успехи совр. биол. 1991. - Т. 111. - Вып. 5. - С. 722-737.
18.Газарян, И.Г. Пероксидазы растений // В кн. Газарян И.Г., Урманцева В.В., Решетникова И.А., Кунаева P.M., Ким Б.Б. Биотехнология пероксидаз растений и грибов. М.: Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. 1992. - Т. 36. С. 4-28.
19.Гусев, В.А. Супероксиддисмутаза -радиобиологическое значение и возможности / В.А. Гусев // Вопр. мед химии. 1980. - Т.24. - Вып.З. - С. 291-301.
20. Осипов, А.Н. Активные формы кислорода и их роль в организме / А.Н. Осипов // Успехи биол. химии. - М.: Наука. 1990. - Т.31. - С. 180- 208 .
21. Полесская, О.Г. Изменение активности антиоксидантных ферментов в листьях и корнях пшеницы в зависимости от формы и дозы азота в среде / О.Г. Полесская, Е.И. Каширина, Н.Д. Алехина // Физиология растений. – 2004. – Т. 51 – № 5. – С. 686-691.
22. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образоватедльный журнал. -2000.-№12.- С.13-19
